Skrivbordsmikroskopmikroskop: 10 steg (med bilder)

2024 Författare: John Day | [email protected]. Senast ändrad: 2024-01-30 12:45

I optiska mikroskop finns det en grundläggande avvägning mellan synfält och upplösning: ju finare detaljer, desto mindre region avbildas av mikroskopet. Ett sätt att övervinna denna begränsning är att översätta provet och skaffa bilder över ett större synfält. Grundidén är att sy ihop många högupplösta bilder för att bilda en stor FOV. I dessa bilder får du se både hela provet och fina detaljer i valfri del av provet. Resultatet är en bild som består av cirka en miljard pixlar, mycket större jämfört med bilderna som tagits av en dSLR eller smarttelefon, som vanligtvis har cirka 10 till 50 miljoner pixlar. Kolla in dessa gigapixellandskap för en imponerande demonstration av den enorma mängden information i dessa bilder.

I den här instruktionsboken kommer jag att gå igenom hur man bygger ett mikroskop som kan avbilda ett 90 mm x 60 mm synfält med pixlar motsvarande 2 μm vid provet (även om jag tror att upplösningen förmodligen är närmare 15 μm). Systemet använder kameralinser, men samma koncept kan tillämpas med hjälp av mikroskopmål för att få ännu finare upplösning.

Jag laddade upp gigapixelbilderna jag fick med mikroskopet på EasyZoom:

1970 National Geographic tidskriftsbild

Virkad duk som min fru gjorde

Diverse elektronik

Andra resurser:

Handledning för optisk mikroskopi:

Optisk upplösning:

Förutom bildsömmar gör de senaste framstegen inom beräknad bildbehandling gigapixelmikroskopi möjlig utan att ens flytta provet!

Steg 1: Utbudslista

Material:

1. Nikon dSLR (jag använde min Nikon D5000)

2. 28 mm brännviddslins med 52 mm gängning

3. 80 mm brännviddslins med 58 mm gängning

4. 52 mm till 58 mm backkopplare

5. Stativ

6. Sju ark av 3 mm tjock plywood

7. Arduino Nano

8. Två H-bridge L9110

9. Två IR -sändare

10. Två IR -mottagare

11. Tryckknapp

12. Två motstånd på 2,2 kOhm

13. Två 150Ohm motstånd

14. Ett 1kOhm -motstånd

15. Fjärrkontroll för Nikon -kamera

16. Svart plakat

17. Hårdvarukit:

18. Två stegmotorer (jag använde Nema 17 Bipolär stegmotor 3.5V 1A)

19. Två 2 mm blyskruvar

20. Fyra kuddblock

21. Två skruvmuttrar

22. Två lager glidbussning och 200 mm linjära axlar:

23. 5V strömförsörjning:

24. Wire wrap wire

Verktyg:

1. Laserskärare

2. 3D -skrivare

3. Insexnycklar

4. Trådskärare

5. Trådlindningsverktyg

Steg 2: Systemöversikt

För att översätta provet flyttar två stegmotorer i linje i ortogonala riktningar ett steg i x- och y -riktningen. Motorerna styrs med två H-broar och en Arduino. En IR -sensor placerad vid foten av stegmotorn används för att nollställa stadierna så att de inte stöter på någon av ändarna av blocken. Ett digitalt mikroskop är placerat ovanför XY -scenen.

När provet är placerat och scenen är centrerad trycker du på en knapp för att påbörja förvärvet. Motorerna flyttar scenen till nedre vänstra hörnet och kameran triggas. Motorerna översätter sedan provet i små steg, eftersom kameran tar ett foto vid varje position.

När alla bilder har tagits sys bilderna ihop för att bilda en gigapixelbild.

Steg 3: Mikroskopmontering

Jag gjorde ett mikroskop med låg förstoring med ett dSLR (Nikon 5000), ett Nikon 28mm f/2.8-objektiv och ett Nikon 28-80mm zoomobjektiv. Zoomlinsen var inställd för brännvidd lika med 80 mm. Uppsättningen av de två linserna fungerar som ett mikroskoprör och objektiv. Den totala förstoringen är förhållandet mellan brännvidden, cirka 3X. Dessa linser är verkligen inte utformade för den här konfigurationen, så för att få ljuset att sprida sig som ett mikroskop måste du placera ett bländarstopp mellan de två linserna.

Montera först objektivet med längre brännvidd på kameran. Klipp en cirkel av svart affischbräda som har en diameter ungefär lika stor som linsens främre yta. Skär sedan en liten cirkel i mitten (jag valde ca 3 mm diameter). Cirkelns storlek bestämmer mängden ljus som kommer in i systemet, även kallat den numeriska bländaren (NA). NA bestämmer systemets laterala upplösning för väldesignade mikroskop. Så varför inte använda en hög NA för denna inställning? Tja, det finns två huvudorsaker. För det första, när NA ökar, blir de optiska avvikelserna i systemet mer framträdande och kommer att begränsa systemets upplösning. I en okonventionell installation som denna kommer detta troligen att vara fallet, så att öka NA så småningom kommer inte längre att hjälpa till att förbättra upplösningen. För det andra beror skärpedjupet också på NA. Ju högre NA, desto grundare skärpedjup. Detta gör det svårt att få objekt som inte är platta i fokus. Om NA blir för högt kommer du att vara begränsad till bildmikroskopglas, som har tunna prover.

Placeringen av bländarstoppet mellan de två linserna gör systemet ungefär telecentriskt. Det betyder att förstoringen av systemet är oberoende av objektavståndet. Detta blir viktigt för att sy ihop bilder. Om objektet har olika djup, kommer utsikten från två olika positioner att ha skiftat perspektiv (som människosyn). Att sy ihop bilder som inte är från ett telecentriskt bildsystem är utmanande, särskilt med så stor förstoring.

Använd 58mm till 52mm objektivets omvända koppling för att fästa 28mm -objektivet på 80mm -objektivet med bländaren placerad i mitten.

Steg 4: XY scendesign

Jag designade scenen med Fusion 360. För varje skanningsriktning finns det fyra delar som måste skrivas ut i 3D: monteringsfäste, två förlängare av glidaggregat och ett skruvfäste. Basen och plattformarna i XY -scenen är laserskurna av 3 mm tjock plywood. Basen rymmer X-riktningsmotorn och reglagen, X-plattformen rymmer Y-riktningsmotorn och reglagen, och Y-plattformen håller provet. Basen består av 3 ark och de två plattformarna består av 2 ark. Filerna för laserskärning och 3D -utskrift finns i detta steg. Efter att ha klippt ut och skrivit ut dessa delar är du redo för nästa steg.

Steg 5: Motorfäste

Med ett trådlindningsverktyg, linda tråd runt ledningarna för två IR-sändare och två IR-mottagare. Färgkoda trådarna så att du vet vilken ände som är vilken. Skär sedan av ledningarna från dioderna, så bara trådtrådarna går sedan. Skjut ledningarna genom styrningarna i motorfästet och skjut sedan in dioderna. Ledningarna är riktade så att de inte syns förrän de lämnar enhetens baksida. Dessa ledningar kan förenas med motortrådarna. Montera nu stegmotorn med fyra M3 -bultar. Upprepa detta steg för den andra motorn.

Steg 6: Scenmontering

Limma ihop skärningarna Base 1 och Base 2, en av dem med sexkantiga öppningar för M3 -muttrarna. När limmet har torkat hammar du M3 -muttrarna på plats. Muttrarna roterar inte när de pressas in i brädet, så du kommer att kunna skruva in bultarna senare. Limma nu det tredje basarket (bas 3) för att täcka muttrarna.

Nu är det dags att montera blymutterfästet. Ta bort eventuella extra glödtrådar från fästet och skjut sedan fyra M3 -muttrar på plats. De sitter tätt, så se till att du tar bort bult- och mutterutrymmet med en liten skruvmejsel. När muttrarna är inriktade skjuter du in muttern i fästet och fäster den med 4 M3-bultar.

Fäst kuddeblocken, skjutreglagen och motorfästet för den X-riktade linjära översättaren på basen. Sätt i ledarmutternheten på ledningsskruven och skjut sedan in skruven på plats. Använd kopplingen för att ansluta motorn till ledningsskruven. Placera skjutreglagen i stavarna och skjut sedan in stavarna i skjutreglagen. Slutligen fäst skjutreglaget med M3 -bultar.

X1- och X2 -plywoodskivorna limmas ihop på ett liknande sätt som basen. Samma procedur upprepas för Y-riktningens linjära translator och provsteget.

Steg 7: Skannerelektronik

Varje stegmotor har fyra kablar som är anslutna till en H-bryggmodul. De fyra kablarna från IR -sändaren och mottagaren är anslutna till motstånden enligt diagrammet ovan. Mottagarnas utgångar är anslutna till analog ingång A0 och A1. De två H-bryggmodulerna är anslutna till stift 4-11 på Arduino Nano. En tryckknapp är ansluten till stift 2 med ett 1 kOhm -motstånd för enkel användarinmatning.

Slutligen är triggknappen för dSLR ansluten till en fjärrslutare, precis som jag gjorde för min CT -skanner (se steg 7). Klipp av fjärrslutarkabeln. Trådarna är märkta enligt följande:

Gul - fokus

Röd - slutare

Vitt - slipat

För att fokusera bilden måste den gula tråden vara ansluten till marken. För att ta ett foto måste både den gula och röda ledningen vara ansluten till jord. Jag anslöt en diod och den röda kabeln till stift 12, och sedan anslöt jag en annan diod och den gula kabeln till stift 13. Inställningen är enligt beskrivningen i DIY Hacks and How-Tos instruerbar.

Steg 8: Skaffa Gigapixel -bilder

Koden för gigapixelmikroskopet bifogas. Jag använde Stepper-biblioteket för att styra motorerna med H-bron. I början av koden måste du ange mikroskopets synfält och antalet bilder du vill få i varje riktning.

Till exempel hade mikroskopet jag gjorde ett synfält på cirka 8,2 mm x 5,5 mm. Därför instruerade jag motorerna att växla 8 mm i x-riktningen och 5 mm i y-riktningen. 11 bilder förvärvas i varje riktning, totalt 121 bilder för hela gigapixelbilden (mer information om detta i steg 11). Koden beräknar sedan antalet steg som motorerna behöver göra för att översätta scenen med detta belopp.

Hur vet stadierna var de är i förhållande till motorn? Hur översätts etapperna utan att träffa någon av ändarna? I installationskoden skrev jag en funktion som flyttar scenen i varje riktning tills den bryter vägen mellan IR -sändaren och IR -mottagaren. När signalen på IR -mottagaren sjunker under någon tröskel, stannar motorn. Koden spårar sedan scenens position i förhållande till denna utgångsposition. Koden är skriven så att motorn inte översätts för långt vilket skulle få scenen att springa in i den andra änden av ledningsskruven.

När scenen har kalibrerats i varje riktning översätts scenen till mitten. Med hjälp av ett stativ placerade jag mitt dSLR -mikroskop över scenen. Det är viktigt att rikta in kamerafältet mot de korsade linjerna på provsteget. När scenen är i linje med kameran tejpade jag ner scenen med lite målartejp och placerade sedan provet på scenen. Fokus justerades med stativets z-riktning. Användaren trycker sedan på tryckknappen för att påbörja förvärvet. Scenen översätts till nedre vänstra hörnet och kameran triggas. Scenen scannar sedan provet, medan kameran tar ett foto vid varje position.

Det finns också en kod för felsökning av motorer och IR -sensorer.

Steg 9: Sy sönder bilder

Med alla förvärvade bilder står du nu inför utmaningen att sy ihop dem alla. Ett sätt att hantera bildsömmar är att manuellt justera alla bilder i ett grafiskt program (jag använde Autodesks Graphic). Detta kommer definitivt att fungera, men det kan vara en smärtsam process och kanterna på bilderna märks på gigapixelbilderna.

Ett annat alternativ är att använda bildbehandlingstekniker för att sy ihop bilderna automatiskt. Tanken är att hitta liknande funktioner i den överlappande delen av intilliggande bilder och sedan tillämpa en översättningstransform på bilden så att bilderna är i linje med varandra. Slutligen kan kanterna blandas ihop genom att multiplicera den överlappande sektionen med en linjär viktfaktor och lägga ihop dem. Detta kan vara en skrämmande algoritm att skriva om du är ny på bildbehandling. Jag arbetade ett tag med problemet, men jag kunde inte få ett fullt tillförlitligt resultat. Algoritmen kämpade mest med prover som hade mycket liknande funktioner hela tiden, till exempel prickarna i tidningsbilden. Bifogad är koden jag skrev i Matlab, men den behöver lite arbete.

Det sista alternativet är att använda program för att sy fotografier med gigapixel. Jag har inget att föreslå, men jag vet att de finns där ute.

Steg 10: Mikroskopprestanda

Om du missade det, här är resultaten: tidningsbild, virkad bordsduk och diverse elektronik.

Specifikationerna för systemet anges i tabellen ovan. Jag försökte avbilda med både ett 28 mm och 50 mm brännviddslins. Jag uppskattade den bästa möjliga upplösningen av systemet baserat på diffraktionsgränsen (cirka 6μm). Det är faktiskt svårt att testa detta experimentellt utan ett högupplöst mål. Jag försökte skriva ut en vektorfil som listades på detta storformat fotograferingsforum, men jag var begränsad av min skrivarupplösning. Det bästa jag kunde avgöra med denna utskrift var att systemet hade en upplösning <40μm. Jag letade också efter små, isolerade funktioner på proverna. Den minsta egenskapen i trycket från tidningen är bläckfläcken, som jag uppskattade också vara cirka 40μm, så jag kunde inte använda den för att få en bättre uppskattning av upplösningen. Det fanns små divoter i elektroniken som var ganska väl isolerade. Eftersom jag kände synfältet kunde jag räkna antalet pixlar som tog upp den lilla divot för att få en uppskattning av upplösningen, cirka 10-15μm.

Sammantaget var jag nöjd med systemets prestanda, men jag har några anteckningar om du vill testa det här projektet.

Scenens stabilitet: För det första, få linjära scenkomponenter av hög kvalitet. Komponenterna jag använde hade mycket mer spel än jag trodde att de skulle. Jag använde bara ett av skjutreglagen i satsen för varje stav, så det var kanske därför scenen inte kändes särskilt stabil. Scenen fungerade tillräckligt bra för mig, men det här skulle bli mer ett problem för system med högre förstoring.

Optik för högre upplösning: Samma idé kan användas för mikroskop med större förstoring. Men mindre motorer med finare stegstorlek kommer att krävas. Till exempel skulle en 20X förstoring med denna dSLR resultera i ett synfält på 1 mm (om mikroskopet kan avbilda ett så stort system utan vinjettering). Electronupdate använde stegmotorer från en CD -spelare i ett fint bygge för ett förstoringsmikroskop. En annan avvägning är grunt skärpedjup, vilket innebär att avbildningen kommer att begränsas till tunna prover och du behöver finare översättningsmekanism i z-riktningen.

Stativets stabilitet: Detta system skulle fungera bättre med ett mer stabilt kamerafäste. Linssystemet är tungt och stativet lutar 90 grader från det läge det är avsett för. Jag var tvungen att tejpa fast stativets fötter för att hjälpa till med stabiliteten. Slutaren kan också skaka kameran tillräckligt för att göra bilderna suddiga.